Градиент к секционированию рабочего процесса CUBE для создания и визуализации органоидов с локализованной дифференцировкой

Биология связи, том 6, Номер статьи: 299 (2023) Цитировать эту статью

1837 г. Доступов

1 Цитаты

76 Альтметрика

Подробности о метриках

Достижения в культуре органоидов привели к созданию различных мини-органов in vitro, которые во многом имитируют нативные ткани. Тем не менее, узким местом остается создание сложных органоидов с рисунком осей тела, а также сохранение ориентации органоидов во время процессов постэкспериментального анализа. Здесь мы представляем рабочий процесс культивирования органоидов с градиентом морфогена с использованием устройства для культивирования CUBE с последующим разделением образцов с помощью CUBE для сохранения информации о направлении градиента. Мы показываем, что сфероиды hiPSC, культивированные с двумя отдельными средами для дифференцировки на противоположных концах CUBE, приводят к локализованной экспрессии соответствующих маркеров дифференцировки, в отличие от гомогенного распределения маркеров в контроле. Мы также описываем процессы крио- и парафинового сечения сфероидов в CUBE для сохранения информации о градиентной ориентации. Этот рабочий процесс от градиентной культуры до секционирования с помощью CUBE может предоставить исследователям удобный инструмент для создания все более сложных органоидов и изучения процессов их развития in vitro.

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) и полученные из них органоиды предлагают прагматичный способ моделирования и изучения формирования тканей и органов на ранних этапах развития человека, поскольку реальные образцы ставят сложные этические проблемы1,2,3,4. Протоколы создания различных органоидов, имитирующих нативные ткани, обычно основаны на последовательном манипулировании активацией или ингибированием сигнальных путей, таких как Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt или BMP, в разные моменты времени, чтобы вызвать дифференцировку в сторону определенных линий, например, в образование органоидов кишечника5, почек6 и легких7, эпибластов8,9 и гаструлоидов10.

Тем не менее, контроль роста и дифференцировки клеток вдоль оси тела остается проблемой в 3D-органоидных культурах. In vitro передне-заднее и дорсально-вентральное паттернирование в органоидах может возникать в результате клеточной самоорганизации11,12 или достигаться путем слияния отдельно дифференцированных органоидов вместе в ассамблоид, например, в церебральных органоидах с разными областями мозга или желчных органоидах с печенью, желчными протоками и т.д. компоненты тракта и поджелудочной железы13,14. Однако ограничением этих методов является то, что, поскольку клетки культивируются в одной однородной среде, уровень контроля с точки зрения пространственной информации, подаваемой клеткам, довольно низок; все клетки внутри кластера клеток, составляющих органоид, получают одни и те же сигналы дифференцировки от сигнальных молекул в среде. In vivo, с другой стороны, градиенты концентрации морфогенов из других источников также способствуют управлению перемещением клеток и какой фенотип или паттерн они должны принять во время развития15,16. Например, формирование нервной трубки зависит от сигналов от хорды и ненейрального слоя эктодермы17, а нефроны почки развиваются путем обмена различными сигналами между зачатком мочеточника и метанефрической мезенхимой18. Таким образом, существует необходимость репликации градиентов морфогена для создания органоидов, которые более похожи на нативные ткани in vivo.

Было разработано несколько инженерных технологий для имитации подачи пространственного градиента сигнальных молекул в клетки in vitro. PSC, сконструированные для экспрессии Sonic Hedgehog (Shh)19, или агарозные шарики, пропитанные морфогенами20, можно поместить близко к развивающемуся органоиду, и диффузия молекул от источника к дифференцирующимся клеткам создаст градиент концентрации морфогенов от высокой к низкой. Кроме того, были разработаны различные модифицированные трансвеллы и микроустройства, которые позволяют культивировать клетки в двух отдельных отсеках среды для генерации градиентов морфогена в противоположных направлениях по клеткам21,22,23,24,25,26. Однако эти технологии не лишены недостатков: (1) они требуют сложных процедур подготовки и настройки, которые нелегко выполнить в большинстве биологических лабораторий без специальных навыков и оборудования, (2) им не хватает контроля над размещением и позиционированием образец в устройстве, и (3) трудно извлечь образец из устройства после эксперимента для дальнейшего анализа, не причинив при этом значительного повреждения образцу или не потеряв ориентацию образца. В частности, способность сохранять информацию об ориентации градиента, которому подвергались клетки, имеет решающее значение для обеспечения надлежащего анализа образца.